【資料】LCの基礎

高速液体クロマトグラフィー（High performance liquid chromatography,
HPLC）は、移動相の液体を加圧して送液し高性能カラムを使用することで
高い分離能を実現したLC で、様々な化学分析の分野で利用されています。

HPLCの装置は、移動相を送液するポンプ、試料を注入するインジェクタ、
試料中の成分を分離するカラム、カラム温度を一定に保つカラム恒温槽、
分離された成分を検出する検出器から構成されます。

本資料は、液体クロマトグラフィー（LC）の分離基礎、検出器、原理に
ついて、分かりやすくまとめております。
HPLCを新たに学習する方、初歩から復習したい方、社内教育に役立つ
資料をお探しの方はぜひご一読ください。

【掲載内容（一部）】
■はじめに
■HPLCの装置
■HPLCにおける分離
■検出

※詳しくはPDFをダウンロードしていただくか、お気軽にお問い合わせください。 （詳細を見る）

クロマトグラフィーでは、固定相と移動相に対する物質の親和性の違いを
利用していますが、HPLCで良く用いられる分離モードは、親和性の種類
により吸着、分配、サイズ排除に大別されます。

主な分離モードとして、「吸着」「分配」「親水性相互作用」
「イオン交換」「サイズ排除」があります。

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吸着クロマトグラフィーは、固定相（充塡剤）の吸着点と分析種との
間の吸着平衡の差を利用して化合物を分離します。

固定相にはシリカゲルやアルミナが用いられ、移動相にはヘキサン、
ジクロロメタンなどが用いられます。異性体の分離などに有効です。

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分配クロマトグラフィーは、固定相に対する分析種の分配平衡の差を
利用して化合物を分離します。

固定相は通常、結合相と呼ばれる化合物を化学的に充塡剤に結合させた
化学結合型充塡剤が用いられます。分配クロマトグラフィーには順相と
逆相の2種類があります。

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順相液体クロマトグラフィーは、固定相として極性の高い化学結合相を
導入した充塡剤を、移動相として低極性の溶媒を用います。

極性の高い化合物が固定相により強く保持されるため、極性の低い化合物が
早く溶出。脂溶性化合物の分析や有機化合物のグループ別分離などに
利用されます。

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逆相液体クロマトグラフィーは、固定相として極性の低い化学結合相を
導入した充塡剤を、移動相として高極性の溶媒を用います。

極性の高い化合物は固定相に保持されにくいため早く溶出し、極性の低い
化合物が遅く溶出します。化学結合相としてオクタデシル基（C18）を
シリカゲルに導入したオクタデシルシリル化シリカゲル（ODS）は、
HPLCで広く利用されている充塡剤です。

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イオン対クロマトグラフィーは、移動相にイオン対試薬と呼ばれる
イオン性化合物（アルキルスルホン酸塩、アルキル4 級アンモニウム塩
など）を添加して、RPCでは保持しないようなイオン性化合物をRPCの
固定相で分離します。

イオン対試薬は、分析対象とは反対の電荷をもつもの、陰イオン性化合物
の場合はアルキル4級アンモニウム塩、陽イオン性化合物の場合は
アルキルスルホン酸塩を用います。

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親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）は、固定相として
アミノ基など高極性の結合相を導入した充塡剤やシリカゲルを、
移動相として水（緩衝液）とアセトニトリルの混合溶液を用います。

RPCでは保持の弱い（極性の高い）化合物の分離に適しています。

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イオン交換クロマトグラフィーは、固定相にイオン交換基（陽イオン交換
の場合はスルホ基など陰イオン性の官能基、陰イオン交換の場合は4級
アンモニウム基など陽イオン性の官能基）を導入した充塡剤を、移動相に
緩衝液など塩を含む水溶液を用いて、イオン性化合物を分離します。
アミノ酸や有機酸、タンパク質の分離等に用いられます。

資料をダウンロードいただくと、陽イオン交換カラムを用いた
タンパク質の分析例をご覧いただけます。

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イオン排除クロマトグラフィーは、イオン交換樹脂を固定相として
用いますが、イオン交換クロマトグラフィーとは異なり、イオン交換基と
分析種間の静電的な反発力を利用します。

有機酸のような弱酸の場合、化合物により酸性溶液中での解離度が異なる
ため、電荷の強さも異なり、イオン交換基と同じ符号の電荷をもつ分析種
の場合は、その電荷の強さによりイオン交換基から受ける反発力が異なります。

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サイズ排除クロマトグラフィーは、固定相と分析種の間の相互作用では
なく移動相中の分析種の分子サイズの違いにより化合物を分離します。

充塡剤の細孔径より小さい分子はカラム内をゆっくり通過する一方、
細孔径より大きい分子はカラム内を素早く通過していきます。

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アフィニティクロマトグラフィーは、タンパク質など生体物質がもつ高い
親和性を利用したクロマトグラフィーで、細胞培養液から特定の
タンパク質を抽出、精製するなどに利用されます。

資料をダウンロードいただくと、Protein Aを固定化したアフィニティカラムに
よるCHO細胞培養液上清からのIgGの精製を示した図をご覧いただけます。

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HPLCには、移動相の組成を保って分離するイソクラティック溶離と、
移動相の組成を変化させて分離を行うグラジエント溶離があります。

一般的に、1成分、あるいは各成分の保持時間に大きな差がない複数成分を
分析する場合はイソクラティック溶離、保持時間に大きな差がある多成分
を分析する場合はグラジエント溶離が用いられます。

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クロマトグラフィーは分離手法なので、分離した分析種を検出する検出器
と適切に組み合わせることで、定量分析が可能になります。

検出器は、適用可能な化合物、感度、選択性などを考慮して選択する
必要があります。

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HPLCで分析する有機化合物の多くは、紫外・可視領域に吸収を有します。
そのため、紫外可視吸光度検出器はHPLCでもっとも広く利用されています。

光源には、重水素放電管（D2ランプ）が用いられますが、可視領域の吸収
を感度良く測定するためにタングステンランプを併用することもあります。

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VWDは、光源の光をグレーティングで分光し、単色光にした後、
フローセルに当て吸光度を測定します。

単一波長による検出を行うので、多成分同時分析で各分析種の極大吸収が
異なる場合は、タイムプログラムで波長を切り替えて検出することが可能です。

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DADはVWDとは異なり、光源からの光を分光せずにセルに照射します。
セルを透過した光を分光し、フォトダイオードを並べた素子
（フォトダイオードアレイ）で検出します。

カラムからの溶出液のUV-Vis スペクトルを記録することが可能。
そのため、多波長同時検出やピーク純度検定、標準物質のUV-Vis
スペクトルとの照合ができ、ピーク同定能力がVWDより優れています。

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光を当てると電子が励起され、励起された電子が基底状態に戻る際
発光する現象を蛍光と呼びます。

蛍光を発する物質を蛍光物質と呼び、このような化合物は蛍光検出器
（FLD）で検出できます。励起光と蛍光の波長は蛍光物質に特有なので、
FLDはUV-Vis検出器にくらべて感度と選択性に優れています。

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■HPLCにおける分離
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示差屈折率検出器（RID）は、移動相と分析種を含むカラムからの溶出液の
屈折率の差を検出します。

すべての化合物の検出に利用できますが、感度は良くなく、目安は
UV-Vis検出器の1/1000以下です。紫外可視吸収や蛍光を持たない化合物
でも検出可能なので、糖類や合成高分子の検出などに用いられます。

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■HPLCの装置
■HPLCにおける分離
■検出

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蒸発光散乱検出器（ELSD）は、カラムからの溶出液中の移動相を蒸発、
除去した後、分析種の粒子の散乱光を検出します。

移動相は揮発する必要があるため、リン酸塩のような不揮発性の塩を含む
移動相は使用できません。また、揮発しやすい分析種は、移動相と共に
揮発してしまうため適用できません。しかし、UV-Vis吸収や発蛍光性の
ない化合物でも検出することが可能です。

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【掲載内容（一部）】
■はじめに
■HPLCの装置
■HPLCにおける分離
■検出

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HPLCのピーク同定は、標準試料のピークの保持時間をもとに行います。
DADのUV-Visスペクトルのような情報が同時に得られる場合は、
スペクトルの照合を加味して同定することもできます。

分析種の定量は、標準試料溶液の濃度系列を調製し、クロマトグラムから
ピーク面積またはピーク高さを求め検量線を作成して行います。

本資料は、HPLCにおけるピーク同定と定量について図を用いて
分かり易く解説し、定量法の絶対検量線と内標準法についても
ご紹介しております。ぜひご一読ください。

【掲載内容(一部)】
■はじめに
■HPLCの装置
■HPLCにおける分離
■検出
■HPLCにおけるピーク同定と定量

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クロマトグラフィーを理解するうえで欠かせない基本的な用語を
まとめました。

また、クロマトグラフィー基本用語で記載している各クロマトグラフ
パラメータのAgilentデータシステムによる出力例をご紹介。

本資料では、ホールドアップ時間(保持されない成分の溶出時間)や
ピーク高さといったクロマトグラムのパラメータなどを分かり易く
掲載しております。ぜひダウンロードしてご一読ください。

【掲載内容(一部)】
■はじめに
■HPLCの装置
■HPLCにおける分離
■検出
■HPLCにおけるピーク同定と定量

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