次世代シーケンス解析

サンガー法によるDNA解析は広く普及している技術であり、ここ数年ではサンガー法の次の世代という位置づけで、「次世代シーケンサー」が各社から発売されてします。しかし、当社では、次世代シーケンサーを用いたDNA解析はサンガー法のような身近な技術と言える状況には程遠いのが現状であると考えます。

イルミナ社の「MiSeq」での受託サービスを行うことによって、次世代シーケンサーでの解析をより多くの人達に利用していただき、将来的にはサンガー法のような普及技術とすることが当社のミッションです。

【特長】
■クローニングする必要がない
■サンガー法では得られなかったデータが得られる
■低価格/短納期で完了

※詳細は資料請求して頂くかダウンロードからPDFデータをご覧下さい （詳細を見る）

ファスマックでは、『次世代シーケンス解析』を承っております。

サンガー法によるDNA解析は広く普及している技術であり、現在は
「遺伝子診断」といったかたちで一般の人にも少しずつ認知されつつあります。

当社は、イルミナ社のMiSeqでの受託サービスを行うことによって、
次世代シーケンサーでの解析をより多くの人達に利用していただき、
将来的にはサンガー法のような普及技術とすることを会社のミッションと
位置づけております。

【ラインアップ】
■アンプリコン解析
■ゲノムドラフト解析
■カスタムサービス
・サンプル調製
・Miseqでのrun
・データ解析

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当社が承っている『次世代シーケンス』では、お客様の目的に沿った
各種プランを設けており、ご要望に応じたご提案を心がけております。

“細菌叢の解析”の例では、PCR産物を解析対象として直接塩基配列を
決定し、通常10,000程度はデータが得られます。

さらに、クローンライブラリー法では得ることが非常に難しかった
マイナーなグループのデータを得ることができます。

【事例概要】
■PCR産物を解析対象として直接塩基配列を決定
■得られる塩基配列のデータは通常10,000を超える
■マイナーなグループのデータが得られる

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当社が承っている『次世代シーケンス』では、お客様の目的に沿った
各種プランを設けており、ご要望に応じたご提案を心がけております。

“野生生物の食性解析”の例では、MiSeqを用いた解析で腸内細菌叢の
解析と同様にPCR産物を直接解析。

具体的には消化管内容物や糞便をサンプルとして、日本バーコード
オブライフ・イニシャチブで動物のバーコーディングに用いられている
COI遺伝子の解析を行い、餌生物の推定を行います。

【事例概要】
■MiSeqを用いた解析では腸内細菌叢の解析と同様にPCR産物を直接解析
■具体的には消化管内容物や糞便をサンプルとして、
　COI遺伝子の解析を行い、餌生物の推定を実施

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『微生物ゲノムドラフト解析パッケージ』は、パッケージ化することによって
リーズナブルにご利用できるサービスです。

受け入れサンプルは、バクテリア（Bacteria）およびアーキア（Archaea）が可能。

オプションサービスとして、Prokkaを用いたオートアノテーション、
コンティグのBLAST解析、Sequence Typeのタイピングをご用意しております。

ご用命の際は、お気軽にお問い合わせください。

【解析概要】
（1）お客様：抽出したゲノムDNAを当社にご送付
（2）当社：受領サンプルのQC作業を行う
（3）当社：MiSeq解析用のアダプターライブラリを調製
（4）当社：MiSeqで2×300 bpランを行う
（5）当社：取得データのアセンブルおよびコンティグを作成

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『ターゲットアンプリコン解析』は、パッケージ化することによって
リーズナブルにご利用できるサービスです。

解析対象領域は、16S V4／18S V9／ITS（gITS7-ITS4）／COI
（mlCOIintF-HCO2198）／MiFish（12S V5）など。

解析対象領域を増幅ターゲットとしたサンプル調製用プライマーを
無償提供し、サンプルをお送りいただきます。

その後、当社でQIIME等を使用し、「菌群組成グラフ」や「ヒートマップ」
としてデータを可視化します。

【オプションサービス（抜粋）】
■解析対象領域長の変更（400-500bp程度）
■Library Mix調製
■レアファクションカーブと主座標分析（PCoA）
■OTUのBLAST解析

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MLST(Multi locus sequencing typing)解析とは、複数の遺伝子領域
(通常7領域以上)の変異をパターン化して、菌のタイピングを行う方法です。

当解析事例(自社データ)は、単離株のゲノムと環境中の菌同定を想定した
試料(単離株のゲノムに環境DNAに混合したもの)を用意し、タイピングを実施。

用意した株はグラム陽性菌、グラム陰性菌で、これらのサンプルについて
Miseqでゲノムシークエンス、タイピングを行いました。

その結果、本手法での解析により、環境DNAに混在した株を同定することが
できました。

【事例概要】
■単離株のゲノムと環境中の菌同定を想定した試料を用意し、
　タイピングを行った
■用意した株はBacillus subtilis subsp.subtilis str. 168
　(グラム陽性菌)、Pseudomonas protegens Pf-5(グラム陰性菌)
■これらのサンプルについてMiseqでゲノムシークエンス、
　タイピングを行った

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海洋研究開発機構 深海・地殻内生物圏研究分野の先生より、
新規海洋性プロテオバクテリアを提供いただき、解析した結果を
ご紹介します。

次世代シーケンサー(MiSeq)を使用して、シーケンシング解析を行い、
paired-endリードを取得。

取得した生リードをクオリティフィルタリングした後、アセンブルを行い、
さらにドラフトゲノム配列から遺伝子を予測しました。

【事例概要】
■生リード：7.3M paired-endリード(2x300bp)
■アノテーションデータ
・遺伝子数：2,417
・rRNA：6
・tRNA：49

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当社では、植物の葉に存在する微生物の群集構造解析を目的とした
アンプリコンサンプルを調製する際に、植物のミトコンドリアおよび
葉緑体由来の増幅を抑制させる目的にPNAの添加を行い、良好な結果を
得ております。

PNAの添加を行わないと取得データの90％程度がホスト由来の増幅産物の
データとなってしまいます。

PNA添加を行うことによって最大で10％程度に抑えることができ、
より解像度の高い餌生物の推定を行うことができています。

【4サンプル単位で条件検討した結果】
■Ct1-Ct4：PNA添加無し
■Mt1-Mt4：ミトコンドリア用ブロックPNA添加
■Pl1-Pl4：葉緑体用ブロックPNA添加
■PM1-PM4：ミトコンドリア用と葉緑体用ブロックPNA添加

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ゲノム編集技術は自由な遺伝子改変を可能にするパワフルなツールですが、
改変個体を選抜する上で、遺伝型解析(ジェノタイピング)は重要な工程です。

次世代シーケンスにより、F0世代でのアリル頻度を評価することで、
交配に用いるべき個体選抜を行うことが可能。

また、培養細胞のゲノム編集実験では1度の実験で多様な変異を持つ
細胞集団が得られ、実験条件によって変異の様子が異なります。

次世代シーケンスなら細胞集団の変異を詳細に評価することが出来ます。

【事例概要】
■CrispRvariantを用いた培養細胞のジェノタイピング
■CRISPR/Casでゲノム編集した培養細胞株からDNA抽出後、
　ターゲットアンプリコンシーケンスをMiseqにて実施
■得られたデータをCrispRvariantにて解析

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魚類のDNAメタバーコーディングに使用されるMiFishを用いて
解析した例をご紹介いたします。

相模川水系の複数地点にて採水を行い、ポリタンクにプールし、
DNAの劣化を防ぐため、採水直後にオスバン消毒液を1ml/L添加。

常温で持ち帰り、ラボにてフィルトレーション、DNA抽出などを行い、
得られたデータをMitoFishに供与してホモロジー検索を行いました。

その結果、検出される魚種数が増加していることが伺え、検出される
魚種数を増やすためにPCR反復が有効であることが示唆されました。

【事例概要】
■ラボにてフィルトレーション、DNAを抽出
■抽出したDNAを用いて、NGSライブラリ調製を行った
■ライブラリ調製は8反復実施
■調整したライブラリはillumina社のMiseqでシーケンスを行った
■得られたデータをMitoFishに供与してホモロジー検索実施

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京都大学生態学研究センターでは、カエデ属を利用するハマキホソガの
多様化や種同士での共存に関わるプロセスを研究されております。

当社が一部解析を受注いたしましたのでご紹介します。

本解析ではハマキホソガ特異的なブロッキングプライマーを使うことで
ホスト由来の遺伝子の増幅を抑えることを可能とし、ホストである
ハマキホソガの同定及び体内の寄生者の網羅的な探索を効率的に実施。

ブロッキングプライマーを用いた解析手法が、外見から検出が困難な
ホストと寄生者の関係を解明する上で有効な手段であることを見出しました。

【事例概要】
■ブロッキングプライマー存在下/非存在下でPCRを実施
■ハマキホソガ幼虫274検体についてCOIアンプリコン解析をMiseqにて実施
■得られたリードから、ハマキホソガ10種と寄生蜂13種を同定し、
　ホスト-寄生者の関係を解明

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選択的膜透過性色素EMAを用いた群集構造解析(自社データ)をご紹介します。

大腸菌が優占した環境サンプルについて、熱処理して殺菌したサンプルと
処理しないサンプルを調整し、EMA処理を行いました。その後、各サンプルに
対してDNA抽出を行い、16Sr RNA遺伝子アンプリコン解析を実施。

その結果、群集構造解析では優占化した大腸菌が死滅したことによって
熱処理したサンプルでは大腸菌はほとんど検出されませんでした。

この他、関連リンクでは、RNAからの逆転写cDNAによる群集構造解析
(自社データ)もご紹介しているので、ぜひご覧ください。

【ワークフロー】
■環境サンプル(熱処理、未処理)を用意
■EMA処理
■光照射
■DNA抽出
■EMA-PCRによるアダプターライブラリーの作成

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土壌サンプルの自社データをご紹介します。

当データは、4地点について各4サンプル解析した結果です。

MiSeqでの取得データについては各サンプルおよそ10万リード程度
得られています。

納品データはhtml形式のファイルが含まれており、グラフ等は
webブラウザでの閲覧が可能なので、ぜひ関連リンクよりご覧ください。

【概要】
■16SrRNAのV4領域のデータを用いた微生物群集構造解析の結果
　（門レベルの分類）
■OTU heatmap
■主座標分析（PCoA）　※オプション
■レアファクションカーブ　※オプション

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『RAISING法』は、ゲノム中の外来DNAの挿入位置を検出する方法です。
少ないDNA量で再現性の高い測定結果がスピーディーに得られます。

ウイルスゲノム挿入部位、ウイルスベクター挿入部位、
創薬ターゲットとなりうる融合遺伝子の検索、
ゲノム編集におけるオフターゲットノックインなど、
外来DNAのホストゲノム上の挿入位置の同定ができます。

【特長】
■目的・ターゲットにあわせて解析のアレンジが可能
■一度の解析で複数の挿入部位を検出可能
■独自技術により再現性の高い結果が得られる

【解析事例】
◎HTLV-1（ヒトT細胞白血病ウイルス）クロナリティ解析
少ないDNA量で素早く検出できるRAISING法の特長を活かし、
プロウイルス量0.032％でも高い検出感度を実現しています。

◎ゲノム編集におけるノックインのオフターゲット検出
CRISPR/Casで作製したノックインマウスについて、NGSとの組み合わせにより
ノックイン効率とオフターゲットサイトの検出を行いました。

※事例やサービスの詳細は「ダウンロード」から資料をご覧ください。 （詳細を見る）

これから次世代シーケンス解析を検討されたい方に向けて、
具体的な解析事例を多数紹介した資料をダウンロードいただけます。
また実際の解析データや関連サービスを本資料内のリンクから閲覧する事も出来、
よりイメージしていただけ易い内容となっております。

★下記「PDFダウンロード」ボタンより、資料をダウンロードいただけます。

〈掲載内容※一部抜粋〉
■次世代シーケンス解析ってどんなメリットがあるの？
■どんなサンプルを調べる事ができるの？
■どういったデータが得られるの？

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